CheckV是一个完全自动化的命令行管道，用于评估单链病毒基因组的质量，包括识别整合前病毒的宿主污染、估计基因组片段的完整性以及识别闭合基因组。

快速链接

快速入门
安装
CheckV数据库
运行CheckV
工作原理
主要输出文件
已知问题
常见问题
支持脚本
引用

快速入门

运行以下命令以安装CheckV、下载数据库并运行程序。将</path/to/database>和<input_file.fna>替换为正确的文件路径

conda install -c conda-forge -c bioconda checkv
checkv download_database ./
export CHECKVDB=</path/to/database>
checkv end_to_end <input_file.fna> output_directory -t 16

安装

安装CheckV有三种方法

• 使用conda或mamba（推荐）：conda install -c conda-forge -c bioconda checkv=1.0.1

• 使用pip：pip install checkv

• 使用docker：见下文部分

如果您决定通过pip安装CheckV，请确保已安装以下外部依赖项

• DIAMOND (v2.1.8): https://github.com/bbuchfink/diamond
• HMMER (v3.3): http://hmmer.org/
• Prodigal-gv (v2.6.3): https://github.com/apcamargo/prodigal-gv

上述列出的版本是经过适当测试的。已知DIAMOND v2.1.9存在一个问题，应避免使用。

如果您决定通过docker安装CheckV，请注意，docker镜像可能不代表最新版本。以下为拉取和运行镜像的命令

docker pull antoniopcamargo/checkv
docker run -ti --rm -v "$(pwd):/app" antoniopcamargo/checkv end_to_end input_file.fna output_directory -t 16

CheckV数据库

如果您使用conda或pip安装，则需要下载数据库

checkv download_database ./

您需要更新环境或使用-d标志指定CHECKVDB位置

export CHECKVDB=/path/to/checkv-db

一些用户可能希望使用自己的完整基因组更新数据库

checkv update_database /path/to/checkv-db /path/to/updated-checkv-db genomes.fna

一些用户可能希望下载特定版本的数据库。请参阅https://portal.nersc.gov/CheckV/中所有以前的数据库版本的存档。如果选择此途径，则需要手动构建DIAMOND数据库

wget https://portal.nersc.gov/CheckV/checkv-db-archived-version.tar.gz
tar -zxvf checkv-db-archived-version.tar.gz
cd /path/to/checkv-db/genome_db
diamond makedb --in checkv_reps.faa --db checkv_reps

数据库经常更新。您可以在此处跟踪这些更新
https://portal.nersc.gov/CheckV/README.txt

运行CheckV

运行CheckV有两种方式

使用单个命令运行完整流程（推荐）

checkv end_to_end input_file.fna output_directory -t 16

使用单独的命令运行流程中的每个步骤

checkv contamination input_file.fna output_directory -t 16
checkv completeness input_file.fna output_directory -t 16
checkv complete_genomes input_file.fna output_directory
checkv quality_summary input_file.fna output_directory

要查看CheckV程序和选项的完整列表，请使用：checkv -h 和 checkv <program> -h

已知问题

• DIAMOND v2.1.9存在一个问题，会导致核心转储
• 对于0.9.0版本，您可能会遇到某些prodigal任务失败的错误。
• 对于>=0.9.0，如果您遇到错误指出diamond数据库未找到，请使用checkv download_database重新下载数据库
• 对于v0.8.1，有时conda安装了DIAMOND的较旧版本，导致错误。请确保conda已安装DIAMOND版本>=2.0.9

工作原理

流程可以分解为4个主要步骤

A：从前病毒中去除宿主污染

• 首先根据与自定义HMM数据库的比较，将基因注释为病毒或微生物
• CheckV在contig上扫描（5'到3'），比较相邻基因窗口之间的基因注释和GC含量
• 使用这些信息在每个内基因位置计算分数，并识别宿主-病毒断点
• 最适合大多数为病毒的contig

B：估计基因组完整性

• 首先使用AAI（平均氨基酸同源性）将蛋白质与CheckV基因组数据库进行比较
• 在确定顶级匹配项后，完整性计算为contig长度（或前病毒的病毒区域长度）与匹配参考长度的比率
• 根据对齐强度报告置信水平
• 通常，高和中置信度估计相当准确
• 较少的情况下，您的病毒基因组可能没有与CheckV数据库有密切匹配；在这些情况下，CheckV根据contig上识别的病毒HMM估计完整性
• 根据发现的HMM，CheckV返回基因组完整性的估计范围（例如，35%至60%的完整性），这代表基于具有相同病毒HMM的参考基因组长度分布的90%置信区间

C：预测闭合基因组

• 直接终端重复（DTRs）

  • contig起始/结束端的20-bp以上重复序列
  • 我们经验中最受信任的签名
  • 可能表示环状基因组或从环状模板复制而来的线性基因组（即concatamer）

• 前病毒

  • 具有预测的宿主边界在5'和3'端的病毒区域（参见面板A）
  • 注意：如果宿主区域已经被移除（例如，使用VIBRANT或VirSorter），CheckV将不会检测到前病毒

• 反转终端重复（ITRs）

  • 连续序列 >20-bp 位于 contig 的起始/结束位置（3' 重复是反转的）
  • 最不可信的签名

• 对于上述所有方法，CheckV 还会检查 contig 是否根据估计的完整性大约是正确的序列长度；这很重要，因为末端重复可以代表宏基因组组装的伪影

D: 总结质量。

基于 A-C 的结果，CheckV 生成一个报告文件并将查询 contig 分配到五个质量级别之一（与 MIUViG 质量级别一致并在此基础上扩展）

• 完整（见面板 C）
• 高质量（>90% 完整性）
• 中等质量（50-90% 完整性）
• 低质量（<50% 完整性）
• 不确定质量

输出文件

quality_summary.tsv

这包含三个主要模块的综合结果，应该是主要参考的输出。以下是一个示例，以展示您数据中可以预期的结果类型

在上述示例中，有 6 个病毒 contig 的结果

• 第一个 5325 bp 的 contig 没有完整性预测，这在 'checkv_quality' 字段中用 'Not-determined' 表示。这个 contig 也没有识别到病毒基因，所以它可能甚至不是病毒。
• 第二个 41803 bp 的 contig 被归类为 '低质量'，因为其完整性 <50%。这个估计是基于 'AAI' 方法。请注意，仅在 quality_summary.tsv 文件中报告高或中等置信度的估计。您可以在 completeness.tsv 中查看更多详细信息。这个 contig 有一个 DTR，但被标记了某种原因（请参阅 complete_genomes.tsv 以获取详细信息）
• 第三个 contig 被认为是 '中等质量'，因为其完整性估计为 80%，这是基于 'HMM' 方法。这意味着它太新颖，无法基于 AAI 估计完整性，但它与 CheckV 参考基因组共享 HMM。请注意，这个值代表下限（这意味着真实完整性可能高于这个值但不会低于这个值）。请注意，这个 contig 也被归类为前病毒。
• 第四个 contig 被归类为 '高质量'，因为其完整性 >90%。然而，请注意 'kmer_freq' 的值为 1.7。这表明病毒基因组在 contig 中重复多次。这些情况相当罕见，但需要注意。
• 第五个 contig 被归类为 '完整'，因为存在直接末端重复（DTR），根据 AAI 方法估计完整性为 100%。这个序列可以确信地被处理为一个完整基因组。

completeness.tsv

详细概述了完整性是如何估计的

在上述示例中，有 4 个病毒 contig 的结果

• 第一个前病毒 contig 使用基于 AAI 的方法估计的完整性为 10.7%（100 x 5713 / 53242.8）。这个估计的置信度很高，基于 3.7% 的相对估计误差，这反过来又基于 aai_id（平均氨基酸身份）和 aai_af（contig 对齐分数）与 CheckV 参考DTR_517517的相关性
• 第二个连续片段使用基于AAI的方法具有100%的完整性，使用基于HMM的方法具有75% - 100%的完整性范围。请注意，连续片段的长度略长于预期的基因组长度37,309碱基对。
• 第三个连续片段根据AAI方法估计为65.8%完整。然而，由于aai_confidence较低（意味着基于AAI的最顶部匹配相对较弱），我们不太信任这个结果。为了保守起见，我们可能希望根据HMM方法报告完整性范围（52-70%）。
• 最后一个连续片段没有基于AAI的匹配，也没有任何病毒HMM，因此我们无法对这个序列说任何话。

contamination.tsv

关于污染估计的详细概述

在上述示例中，有 4 个病毒 contig 的结果

• 第一个连续片段不是一个预测的前病毒
• 第二个连续片段有一个覆盖2182碱基的预测宿主区域
• 第三个6930碱基对的连续片段在左侧有一个已识别的宿主区域
• 第四个101630碱基对的连续片段有103个基因，包括7个病毒和24个宿主基因。CheckV识别了两个宿主-病毒边界

complete_genomes.tsv

关于已识别的潜在完整基因组的详细概述

在上面的例子中，有5个病毒连续片段的结果

• 第一个病毒连续片段有一个253碱基的直接终端重复序列。它被归类为高置信度，基于估计的完整性 > 90%
• 第二个病毒连续片段有一个20碱基的DTR，但由于DTR的低复杂度且不可信，导致置信度较低。DTR也发生了10次，被视为重复的。
• 第三个病毒连续片段有26857 bp的DTR！这表明基因组中有很大一部分是重复的。CheckV将其归类为低置信度，但用户可能需要手动解决这些重复
• 第四个病毒连续片段有91 bp的ITR。这被认为具有中等置信度，基于基于AAI的完整性 > 80%
• 第五个病毒连续片段在两侧都有宿主（前病毒）。然而，CheckV无法评估完整性，因此置信度保持为未确定

常见问题

问题：我可以用CheckV进行病毒预测吗？答：CheckV报告两种类型的病毒特征：（1）基因级针对病毒或宿主HMM的匹配，以及（2）基因组级与CheckV数据库中病毒的匹配。这两种类型的信息当然对于区分病毒和非病毒是有用的。然而，为了正确进行病毒预测，我们建议使用geNomad：https://github.com/apcamargo/genomad

问题：基于AAI和基于HMM的完整性有什么区别？答：基于AAI的完整性产生一个单一的估计完整性值，该值设计得非常准确，在报告的置信水平为中等或高时可以信赖。基于HMM的完整性给出完整性的90%置信区间（例如，30-75%），在这种情况下基于AAI的完整性不可靠。在这个例子中，我们可以有90%的把握（理论上）完整性在30%到75%之间。

问题：kmer_freq字段的意义是什么？答：这是病毒基因组在连续片段中呈现次数的度量。大多数情况下，这非常接近1.0。在罕见的情况下，组装错误可能导致连续片段序列代表病毒基因组的多个连续副本。在这些情况下，基因组_copies将超过1.0。

问：为什么我的DTR拼接体的估计完整性小于100%？答：如果估计的完整性接近100%（例如90-110%），则查询可能已完整。然而，有时不完整的基因组片段可能包含直接终端重复（DTR），在这种情况下，我们应预计它们的估计完整性小于90%，有时甚至更少。在其他情况下，拼接体可能确实是环形的，但估计的完整性是错误的。这也可能发生在查询到 multipartite 基因组的一个完整片段时（RNA 病毒很常见）。默认情况下，CheckV 使用90%的完整性截止值进行验证，但用户在这些模糊情况下可能希望自行判断。

问：为什么我的序列被认为是“高质量”的，尽管它有高污染？答：CheckV 仅根据完整性来确定序列质量。宿主污染很容易去除，因此不计入这些质量等级。

问：我进行了分箱并生成了病毒MAGs。我可以在这些上使用CheckV吗？答：CheckV 可以估计完整性但不能估计污染。在运行CheckV之前，您需要将每个MAG的拼接体连接成一个单一序列。

问：我可以用CheckV从全基因组（元基因组）预测（前）病毒吗？答：可能可以，尽管这还没有经过测试。相反，我们建议使用geNomad: https://github.com/apcamargo/genomad

问：如何处理没有完整性估计的假“封闭基因组”？答：在某些情况下，您可能无法验证具有终端重复或前病毒整合位点的序列的完整性。DTR是相当可靠的指标（>90%的时间），在没有完整性估计的情况下可能可以信赖。然而，完整的前病毒和ITR是可靠性较低的指标，因此需要>90%的估计完整性。

问：为什么我的拼接体被分类为“质量未确定”？答：这发生在序列与CheckV参考基因组没有足够相似度以自信地估计完整性，并且没有病毒HMM的情况下。这种情况可能有几种解释，按可能性顺序排列：1) 您的拼接体非常短，并且偶然情况下它没有与CheckV参考共享任何基因，2) 您的拼接体来自一个非常新颖的病毒，它与CheckV数据库中的所有基因组都亲缘关系较远，3) 您的拼接体根本不是病毒，因此与任何参考都不匹配。

问：如何处理“质量未确定”的序列？答：虽然无法估计这些序列的完整性，但您可以选择分析长度超过一定值（例如>30 kb）的序列。

问：为什么包括0个病毒基因的序列出现在CheckV输出中？答：目前，CheckV假设输入序列代表病毒，并试图估计其质量。一些输入序列可能来自细菌、质粒或其他来源，因此可能检测到0个病毒基因。

支持代码

基于成对ANI的快速基因组聚类

首先，创建一个blast+数据库
makeblastdb -in <my_seqs.fna> -dbtype nucl -out <my_db>

接下来，使用blast+包中的megablast进行所有序列的全对全blastn
blastn -query <my_seqs.fna> -db <my_db> -outfmt '6 std qlen slen' -max_target_seqs 10000 -o <my_blast.tsv> -num_threads 32

接下来，通过组合序列对的局部比对来计算成对ANI
anicalc.py -i <my_blast.tsv> -o <my_ani.tsv>

最后，使用MIUVIG推荐参数（95% ANI + 85% AF）执行UCLUST-like聚类
aniclust.py --fna <my_seqs.fna> --ani <my_ani.tsv> --out <my_clusters.tsv> --min_ani 95 --min_tcov 85 --min_qcov 0

文件 <my_clusters.tsv> 包含聚类结果。第一列是集群代表，第二列包含集群成员。文件 <my_ani.tsv> 包含成对ANI结果。列包括

• query_id：查询标识符
• target_id：checkv参考基因组标识符
• alignment_count：blastn比对数量
• ani：平均核苷酸身份
• query_coverage：比对覆盖查询基因组的百分比
• target_coverage: 目标基因组由比对覆盖的百分比

引用

如果您在研究中使用了该软件，请引用
Nayfach, S., Camargo, A.P., Schulz, F. et al. CheckV评估了基于宏基因组组装的病毒基因组的质量和完整性。自然生物技术 39, 578–585 (2021)。https://doi.org/10.1038/s41587-020-00774-7